饲料中盐酸克伦特罗（β-兴奋剂）的测定 NY438-2001

饲料中盐酸克伦特罗（β-兴奋剂）的测定 NY438-2001 　 1、范围 　　本标准高效液相色谱（HPLC）法和气相色谱—质谱（GC—MS）法分别适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中盐酸克伦特罗的筛选监测与确证。 2、引用标准 　　下列标准中所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版式本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB/T 14699.1—1993 饲料采样方法 3、方法原理 　　用加有甲醇的稀酸溶液将饲料中的盐酸克伦特罗盐酸盐溶出，溶液碱化，经液液萃取和固相萃取净化后，直接在HPLC仪上分离、测定，或经衍生后于GC—MS仪器上分离、检测。 4、试剂和材料 　　以下试剂除特别注明者外均为分析纯，水为蒸馏水，甲醇、乙腈为色谱纯。 4.1 提取液：05%偏磷酸溶液（14.29g偏磷酸溶解于水，并稀释至1L）：甲醇=80：20。 4.2 2mol/L氢氧化钠溶液：20g氢氧化钠溶于250mＬ水中。 4.3 液液萃取用试剂 4.3.1 乙醚。 4.3.2 无水硫酸钠。 4.4 氮气。 4.5 0.02mol/L盐酸溶液。 4.6 固相萃取（SPE）用试剂 4.6.1 30mg/lcc Oasis HLB固相萃取小柱或同等效果净化柱。 4.6.2 甲醇。 4.6.3 SPE淋洗液 4.6.3.1 淋洗液—1：含2%氨水的5%甲醇水溶液。 4.6.3.2 淋洗液—2：含2%氨水的30%甲醇水溶液。 4.7 HPLC专用试剂 4.7.1.1 贮备液，200μg/mL：1000mg盐酸克伦特罗溶于0.02mol/L盐酸溶液并定容至50mL。 4.7.1.2 工作液，200：用微量移液器移取贮备注液500uL以002盐酸溶液稀翻滚释至50。 4.7.1.3 标准系列：用微量移液器移取工作液25、50、100、500、1000uL，以0.02盐酸溶液稀释至2，该标准系列的相应浓度为：0.025、0.050、0.100、0.500、1.00ug/mL。 4.7.2 HPLC流动相：1mL1：1磷酸（优级纯）用去离子水稀释至1L，并按100：12的比例和乙腈混合，用前超声脱气5min。 4.8 GC—MS专用试剂 4.8.1 盐酸克伦特罗标准溶液 4.8.1.1 贮备液，200ug/mL：10.00mg盐酸克伦特罗溶于甲醇并定容至50mL。 4.8.1.2 工作液，2.00ug/mL：用微量移液器移取贮备液500uL以甲醇稀释至50mL。 4.8.1.3 标准系列：用微量移液器移取工作液25、50、100、500、1000uL，以甲醇稀释至2mL，该标准系列的相应浓度为：0.025、0.050、0.100、0.500、1.00ug/mL。 4.8.2 衍生剂：N，O—双三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）。 5 仪器、设备 5.1 实验室常用仪器设备。 5.2 分析天平：感量0.001g；感量0.00001g。 5.3 超声水浴。 5.4 离心机：能达4000rpm。 5.5 分液漏斗：150mL。 5.6 电热块或沙浴：可控制温度至50~70±5℃。 5.7 烘箱：温度可控制在70±5℃。 5.8 高效液相色谱仪：具有C18柱（如3.9×150mm，5um或类似的分析柱）和UV检测器或二极管阵列检测器。 5.9 气相色谱—质谱联用仪：装有弱极性或非极性的毛细管柱的气相色谱仪和具有电子轰击离子源和检测器。 6 样品的制备 　　取具有代表性的饲料样品，用四分法缩减分取200g左右，粉碎过0.45mm孔径的筛，充分混匀，装入磨口瓶中备用。 7 分析瞒步骤 7.1提取：称取样品5g，精确至0.001g，置于100mL三角瓶中，准确加入提取液（4.1）50mL，振摇使全部润湿，放在超声水浴中超声提取15min，期间每5min用手振摇一次。超声结束后，手摇至少10sec，并取上层液于离心机上4000rpm下离心10min。 7.2净化：准确吸取上清液10.00mL，置150mL分液漏斗中滴加2mol/L氢氧化钠溶液（4.2），充分振摇，将PH调至11~12，溶液用30、25mL乙醚萃取两次，令醚层通过无水硫酸钠干燥，用少许乙醚淋洗分液漏斗和硫酸钠，并用乙醚定容至50mL。准确吸取25.00mL于50mL烧杯中，置通风橱内、50℃加热块或沙浴上蒸干，残渣溶于2.00mL 0.02mol/L盐酸溶液（4.5），取1.00mL置于预先已分别用1mL甲醇和1mL去离子水处理过的SPE小柱上，用注射器稍试加压，使其过柱速度不超过1mL/min，再先后分别用1mlSPE淋洗液—1（4.6.3.1）和—2（4.6.3.2）淋洗，最后用甲醇洗脱，洗脱液置70±5℃沙浴上、用氮气吹干。 7.3测定 7.3.1 HPLC法（筛选法） 7.3.1.1 于净化、吹干的样品残渣中准确加入1.00~2.00mL 0.02mol/L盐酸溶液，充分振摇、超声，使残渣溶解，必要时过0.45um的滤膜，清液上机测定，用盐酸克伦特罗标准系列进行单点或多点校准。 7.3.3.2 HPLC测定参数设定： 　　色谱柱：C18，4um。 　　柱温：室温。 　　流动相：0.05%磷酸水溶液：乙腈=100：12，流速：10ml/min。 　　检测器：二极管阵或UV检测器。 　　检测波长：210nm或243nm。 　　进样量：20~50uL。 7.3.3.3 定性定量方法 　　定性方法：除了用保留时章定性外，还可用二极管阵列测定盐酸克伦特罗紫外光区的特征光谱，即在210、243和296nm有三个峰值依次变低的吸收峰。 定量方法：积分得到峰面积，而后用单点或多点校准法定量。 7.3.2 GC—MS法（确证法） 7.3.2.1 衍生：于净化、吹干的样品残渣中加入BSTFA 50ul，充分涡旋混合后，置70±5℃烘箱中，衍生反应30min。凉至室温后即可上机测定。同时用盐酸克伦特罗标准系列做同步衍生。 7.3.2.2 GC—MS测定参数设定： 　　载气：He，柱头压：7psi。 　　进样口温度：260℃。 　　进样量：1uL，不分流。 　　柱温程序：70℃保持1min，以25℃/min速度升至200℃，于200℃保持6min，再以25℃/min的速度升至280℃并保持2min。 　　EI源电子轰击能：70eV。 　　检测器温度：200℃。 　　接口温度：250℃。 　　质量扫描范围：60~400AMU。 　　溶剂延迟：7min。 　　检测用克伦特罗三甲基硅烷衍生物的特征质谱峰：M/Z=86、187、243、262 7.3.2.3 定性定量方法 　　定性方法：样品与标准品保留时间相差不大于3sec。特征离子基峰百分数与标准品相差不大于20%。 定量方法：选择离子监测（SIM）法计算峰面积，单点或多点校准法定量。 　　8 分析结果的表述 　　分析结果表示为盐酸克伦特罗在饲料中所占的比例，mg/kg： 　　　　　　　A 　　　　w=————×D 　　　　　　　m 其中：w—每千克样品中盐酸克伦特罗的质量，mg/kg； 　　　A—HPLC或GC—MS色谱峰的面积对应的盐酸克伦特罗的质量，ug； 　　　D—稀释倍数； 　　　m—所称量的样品质量，g。 　　9 允许差 　　HPLC法两个平行测定的相对偏差不大于10%，GC—MS法主要用于定性确证盐酸克伦特罗的存在，其两个平行测定的相对偏差不大于20%。