猪瘟检疫技术规范

中华人民共和国国家标准 GB 16551_1996 猪瘟检疫技术规范 Technical code of quarantine for swine fever 1996-10-03发布1997-02-01实施 国家技术监督局发布 中华人民共和国国家标准 GB 16551_1996 猪瘟检疫技术规范 Technical code of quarantine for swine fever 　 1 主题内容与适用范围 本标准规定了猪瘟群体检疫、个体检疫、实验室检验、综合判定和检疫后处理的技术规范。 本标准适用于猪瘟的检疫。 2 引用标准 GB 16548-1996 畜禽病害肉尸及其产品无害化处理规程 3 群体检疫 3.1经核实已按规定接种合格的猪瘟疫苗，注射后一月内未发现疑似猪瘟的患猪，并处在免疫有效期内，可认为免疫符合要求。如未接种疫苗，或接种不符合要求，或接种后又发现疑似猪瘟的病猪，必须进行补充免疫接种，至免疫有效期开始未发生异常，或认为免疫合格；如免疫接种后再发生疑似猪瘟患猪，必须进行临床检查、解剖检查和实验室检查，在排除猪瘟染疫的可能性之后，方可认为免疫合格 3．2检查全群的健康状况，有否异常表征。如发现猪群中被检猪只体温在40.5℃以上，倦怠、食欲不振、精神萎顿，可视粘膜充血、出血或有不正常分泌物、发绀、便秘腹泻交替，或其他疑似猪瘟的症状，作可疑猪瘟对待，全群隔离饲养，作进一步诊断。 此外，仔猪有衰弱、震颤或发育不良等现象时，可怀疑母猪携带猪瘟病毒，应进行实验室确诊。 3．3对群体中检出的可疑患猪可抽样进行解剖检查，下述病变作为综合诊断定性的依据之一： a．肾皮质色泽变淡，有点状出血； b．淋巴结外观充血肿胀，切面周边出血，呈红白相间的“大理石样”； c．脾脏不肿长，边缘发现楔状梗死区； d．喉头、膀胱有小点出血； e．全身出血性变化，多呈小片或点状； f．回盲瓣、回肠、结肠形成“钮扣状肿”（慢性猪瘟）； g．公猪包皮积尿。 3．4经检疫认为免疫合格，临床检查无异常；或发现疑似病例，经解剖检查、实验室检验等综合性诊断，证明不是猪瘟，应作为非猪瘟群对待。但易地饲养时，必须先隔离两周以上，经观察无异常方准与当地猪群混养。 4个体检疫 猪只作为单个检疫对象时，应进行认真的个体检疫。 4．1个体检疫的内容包括： a．查明产地有否疫情或查验产地检疫证明； b．查验防疫证明； c．临床检查。 4．2如上述三项均无疑问，可作为猪瘟非疫猪对待。 4．3如4.1c项无问题，而4.1a、两项有问题，可再次补充免疫接种，隔离15日无异常按非猪瘟猪对待。如免疫后有可疑症状，应继续隔离观察，如仍不能确诊，须进行解剖检查和实验室检验。 4． 4如4.1a、b两项无问题，4.1c项有问题应隔离观察，如仍不能确诊，须作解剖检查和实验室检验。 5实验室检验 5． 1有下列情形之一者应进行实验室检验： a．产地定期检疫； b．非疫区对从外地引进的猪进行全群检查或抽检； c．发现疑似猪瘟患猪或“非典型猪瘟”，母猪繁殖障碍和仔猪先天性痉挛病例须予确诊； d．原认为非疫群中或从非疫区引进猪群中发现可疑猪瘟或病毒携带者，须予确诊； e．发现疑似猪瘟暴发流行，在采取紧急防治措施的同时须作出确切诊断，或解除封锁前须查明猪体带毒情况； f．有重大疫病（如非洲猪瘟）嫌疑须作出鉴别诊断； g．交易双方共同要求，或农牧主管部门要求进行确诊； h．经群体检疫或个体检疫，需要进一步确诊者。 5．2下述方法，其试验结果可作为检疫定性的依据之一。 5．2．1兔体交叉免疫试验，见附录A（补充件）。 5．2．2免疫酶染色试验，见附录A（补充件）。 5．2．3病毒分离与增毒试验，见附录C（补充件）。 5．2．4直接免疫荧光抗体试验，见附录D（补充件）。 6综合判定 发病不分年龄、季节，临床症状明显，解剖检查病变典型，用5.2中任一试验获阳性结果；或临床症状和发病情况不详，尸体解剖检查变典型，5.2中所列任一试验获阳性结果；发病情况、临床症状、病理变化不详、不明显或不典型，但5.2中所列试验的两项获阳性结果；这些情况均可判定为猪瘟毒感染猪。 7检疫后处理 在群体或个体检疫中，凡经综合判定为猪瘟者，其群体或个体一律GB 16548处理。 附录A 兔体交叉免疫试验 （补充件） 将病猪的淋巴结和脾脏，磨碎后用生理盐水作1：10称释，对3只健康家兔作肌肉注射，5mL/只，另设3只不注射病料的对照兔，间隔5d对所有家兔静脉注射1：20的猪瘟兔化病毒（淋巴脾脏毒），1mL/只，24h后，每隔6h测体温一次，连续测96h，对照组2/3出现定型热或轻型热，试验成立。试验组的试验结果判定见表A1。 表A1兔体交叉疫试验结果判定 接种病料后体温反应 接种猪瘟兔化弱 毒后体温反应 结果判定 - - 含猪瘟病毒 - + 不含猪瘟病毒 + - 含猪瘟兔化病毒 + + 含非猪瘟病毒热原性物质 注：“+”表示多于或等于三分之二的动物有反应。 附录B 免疫酶染色试验 （补充件） B1 解剖检查时采病畜扁桃体、脾、肾、淋巴结作压印片或冰冻切片。标本自然干燥后，在2%戌二醛和甲醛等量混合液中固定10min，干后，置冰箱内待检。 操作方法 B1.1 将标本浸入0.01%过氧化氢或0.01%迭氮钠的Tris-HCL缓冲液中，室温下作用30min. B1.2 用PH7.4 0.02mol/L磷酸缓冲盐水漂洗5次，每次3min,风干。 B1.3 将标本置于湿盒内，滴加1：10酶标记抗体，覆盖标本面上，置37℃作用45min. B1.4 用PH7.40.02mol/L磷酸缓冲盐水-1%吐温缓冲液漂洗5次，每次2~3min. B1.5 将标本放入DAB（4-二甲氨基偶氮苯）Tris-HCL液内，置37℃温箱作用3 min. B1.6 用PH7.40.02mol/L磷酸缓冲盐水冲洗3~4次，每次2~3 min.，再用无水洒精、二甲苯脱水，封片检查。 B1.7 用显微镜检查，如细胞染成深褐色为阳性；黄色或无色为阴性。猪瘟兔化弱毒接种的猪组织细胞浆成微褐色，与强毒侏感染有明显区别。 附录C 病毒分离与增毒试验 （补充件） 本试验可用来分毒和扩增病毒数量以提高检疫的敏感性。 C1 将2g扁桃体或脾脏，剪成小块，加上灭菌砂在乳钵中研成匀浆。用Hank”s液或MEM配成20%悬液，加上青霉素（使终浓度为500单位/mL）和链霉素（使终浓度为500μg/mL），室温下放置1h，3000r/min离心15min，取用上清液。 C2 将PK15单层细胞用胰酶消化分散后，800r/min离心10min，用含无BVDV的5%胎牛血清的MEM配成2×106个细胞/mL悬液。 C3 9份细胞悬液(C2)加1份病料悬液(C1)接种于转瓶或微量细胞培养板。另设不加病料的对照若干瓶（孔），于接种后1、2、3d.分别将2瓶（孔）培养物及1瓶（孔）对照用Hank“s液或BVDV洗涤2次，每次5 min，用冷丙酮固定10 min. C4 进行免疫酶染色或免疫荧光染色，镜检。 附录D 直接免疫荧光抗体试验 （补充件） D1采样 群体检疫中，待检可疑猪不少于三例，其中至少二例为早期患猪，剖杀后或从活体摘取口腭扁桃体。后期病猪剖杀后采扁桃体和肾脏。个体检疫中，剖杀可疑猪采扁桃体和肾脏。所采组织样品必须新鲜。 D2送检 采样后应尽快送检，如当日不能送出，必须冻结保存，避免组织腐败、自溶。 D3切片 将样品组织块修切出1cm×1cm的面，不经任何固定处理，直接冻贴于冰冻切片托上（组织块太小时，如活摘的扁桃体可用冰冻切片机专用的包埋剂或化学浆糊包埋）,进行切片。切片厚度要求5~7μm。将切片展贴于0.8~1mm厚的洁净载玻片上。 D4固定 将切片置纯丙酮中固定15 min，取出立即放入0.01mol/L，PH7.2的磷酸缓冲盐水中，轻轻漂洗3~4次。取出，自然干燥后，尽快进行荧光抗体染色。 D5荧光抗体染色 将猪瘟荧光抗体滴加于切片表面，置湿盒内于37℃作用30 min。取出后放入磷酸缓冲盐水中充分漂洗，再用0.5 mol/L，PH9.0~9.5碳酸盐缓冲甘油封固盖片（0.17 min厚）。染色后应尽快镜检。必要时可低温保存待检。 D6镜检 将染色后的切片标本置激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。 D7判定 于荧光显微镜视野中，见扁桃体隐窝上皮细胞或肾曲小管上皮细胞浆内呈现明亮的黄绿色荧光，判为猪瘟病感染阳性。 附加说明： 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准由农业部动物检疫所负责起草。 本标准主要起草人杨承谕、郑志刚、仰惠芬、邵振华。 中华人民共和国国家标准