猪流行性腹泻诊断技术

猪流行性腹泻诊断技术 　　猪流行性腹泻是猪的严重传染病之一，症状与猪传染性胃肠炎相似，病毒形态上也基本相同，但两者的抗原性不一样。本标准是根据国内研究成果和参考国外同类研究成果编写的。 　　本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录。 　　本标准由农业部畜牧兽医局提出。 　　本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 　　本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国人民解放军军需大学。 　　本标准主要起草人:马思奇、王明、宣华、冯力、佟有恩。 　　1范围 　　本标准规定了猪流行性腹泻(PED)的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测抗体的血清中和试验、间接ELISA试验技术。 　　本标准适用于对猪流行性腹泻的诊断、产地检疫及流行病学调查等。 　　2病毒分离与鉴定 　　2.1材料准备 　　2.1.1器材 　　倒置显微镜，冷冻离心机，微孔滤器，细胞培养瓶，盖玻片，温箱等。 　　2.1.2培养基及溶液的配制 　　磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞培养液、病毒培养液及N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES)液(配制方法见附录A)。 　　2.1.3细胞 　　Vero细胞系。 　　2.2病毒分离 　　2.2.1病料采集 　　采病仔猪空肠内容物及小肠内容物用于分离病毒，样品冷冻保存。 　　2.2.2病料处理 　　将采集的小段空肠连同肠内容物用含1000 IU/mL青霉素、1000μg/mL链霉素、PBS液制成5倍悬液，在4℃条件下3000r/min离心30min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分装，-20℃保存备用。 　　2.2.3接种及观察 　　将过滤液(病毒培养液的10%)接种于Vero细胞单层上，同时加过滤液量50%的病毒培养液，37℃吸附1h，根据组织培养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量，置37℃培养，逐日观察3d～4d，按致细胞病变作用(CPU变化情况，可盲传2代～3代。 　　2.3结果判定 　　CPE变化的特点是:细胞面粗糙，颗粒增多，有多核细胞(7个～8个甚至几十个)，并可见空斑样小区，细胞逐渐脱落，这是特征性的CPE，可与(猪)传染性胃肠炎(TGE)病毒的CPE相区别。同时在细胞培养瓶中加盖玻片，收毒后用直接荧光做鉴定试验。有条件时可进行电镜观察，用负染法在阳性样品中电镜观察可见到冠状病毒粒子。 　　3直接荧光抗体法 　　3.1材料准备 　　3.1.1器材:荧光显微镜、冷冻切片机、载玻片、盖玻片、温箱、滴管等。 　　3.1.2荧光抗体(FA)。 　　3.1.3溶液配制:磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1%伊文思蓝原液、磷酸盐缓冲甘油(配制方法见附录B)。 　　3.2操作方法 　　3.2.1标本片的制备 　　3.2.1.1组织标本 　　采急性期内(5d～7d)患猪空肠中段的粘膜上皮做涂片或肠段做冷冻切片(4μm～7μm)，丙酮中固定10min ，置PBS中浸泡10min～15min，风干或自然干燥。 　　3.2.1.2细胞培养盖玻片 　　将分离毒细胞培养24h～48h的盖玻片及阳性、阴性对照片在PBS中冲洗数次，放入丙酮中固定10min ，再置于PBS中浸泡10min～15min，风干。 　　3.2.2 FA染色 　　3.2.2.1用0.02%伊文思蓝溶液将FA稀释至工作浓度(1:8以上合格)。 　　3.2.2.2 4000r/min离心10min，取上清液滴于标本上。 　　3.2.2.3 37℃恒温恒湿染色30 min ，用PBS冲洗3次，依次为3min、4min、5min，风干，滴加磷酸盐缓冲甘油，盖玻片封固，荧光显微镜检查。 　　3.2.3结果判定 　　判定标准:在荧光显微镜下检查，被检标本的细胞结构应完整清晰。并在阳性、阴性对照均成立时判定。在胞浆中见到特异性苹果绿色荧光判定为阳性，如所有细胞浆中无特异性荧光判定为阴性。 　　可根据细胞内荧光亮度强、弱分别作如下记录: 　　a)++++:呈闪亮苹果绿色荧光； 　　b)+++:呈明亮苹果绿色荧光； 　　c)++:呈一般苹果绿色荧光； 　　d)+:呈较弱绿色荧光； 　　e)-:呈红色。 　　结果为a)～d)者均判为阳性。 　　4双抗体夹心ELISA 　　4.1材料准备 　　4.1.1器材:定量加液器、微量移液器及配套吸头、96孔或40孔聚乙烯微量反应板、酶标测试仪。 　　4.1.2猪抗PED-IgG及猪抗PED-IgG-HRP(HRP为辣根过氧化物酶)。 　　4.1.3溶液配制:洗液、包被稀释液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、底物溶液、终止液〔配制方法见附录C〕。 　　4.1.4待检样品:发病仔猪粪便或肠内容物，用浓盐水1:5稀释，3000r/min离心20min，取上清液待检。 　　4.2操作方法 　　4.2.1冲洗包被板 　　向各孔注入无离子水，浸泡3min甩干，重复3次，甩干孔内残液，在滤纸上吸干。 　　4.2.2包被抗体 　　用包被稀释液稀释猪抗PED-IgG至使用倍数，每孔加100μL，置4℃过夜，弃液，用洗液冲洗3次；每次3min。 　　4.2.3加样品 　　将被检样品用样品稀释液(见第C.3章)做5倍稀释，加入两孔，每孔100μL，每块反应板设阴性抗原、阳性抗原及稀释液对照各两孔。置37℃作用2h，弃样品，冲洗同4.2.2。