《黑龙江畜牧兽医》：转基因植物表达猪疫苗的研究

      利用转基因植物表达疫苗是植物基因工程技术与医学免疫学相结合而发展起来的新的研究方向。迄今为止，大部分植物表达疫苗的免疫原性都得到了证实。植物表达的疫苗与传统疫苗相比，具有生产成本低、安全性高、贮运简单、生物活性高和可直接食(饲)用等优点，其应用前景十分可观。植物表达的疫苗作为一种新型疫苗非常突出的一个特点是植物细胞壁具有“生物胶囊”作用，可以抵抗胃肠道中各种蛋白消化酶，为植物细胞中的抗原蛋白提供一定的保护，从而更有利于激发胃肠道黏膜乃至全身的免疫反应。因此。直接把携带疫苗的植物组织作为饲料喂猪，能有效地防治各类猪传染病，尤其是胃肠道传染病。另外，也可将转基因植物作为生物反应器生产抗原蛋白，再经分离、提纯等步骤制成疫苗。

　　1利用转基因植物表达疫苗的原理与方法 。

　　利用转基因植物表达疫苗的原理是通过植物遗传转化体系表达病原体的抗原基因，从而获得特异性的疫苗。以植物作为抗原生产投药体系，主要通过两种表达系统实现：一种是建立稳定表达植株，通过农杆菌或基因枪介导等方式，将抗原基因整合到植物细胞核或叶绿体基因组中，这些植株在生长过程中表达目的产物。并把这种性状遗传给子代，形成稳定的植物品系；另一种是瞬时表达系统，构建带有抗原基因的植物病毒载体，再通过病毒感染受体植物使之表达，病毒在植物体内增殖水平高、繁殖速度快，因此在短期内就能够获得大量的外源蛋白。

　　2受体植物的选择

　　目前，用于表达猪疫苗的植物主要是烟草。烟草易于转化及表达外源基因，叶片提取液也可直接用于注射或口服，对于快速鉴定外源疫苗的表达性能和抗原性十分方便，但烟草中含有生物碱，不适合作饲用疫苗。马铃薯块茎中含有丰富的营养物质，且便于贮藏和运输，但发芽的马铃薯有毒，大量生食可能会出现中毒反应。有学者用莴苣、苜蓿等植物作为表达体系，这些植物的叶片可用作饲料，但叶片难于贮存，若制成冻干粉保存无疑会增大成本；还有学者用玉米、小麦等农作物作为表达体系，这些农作物种植面积广泛，其种子的蛋白含量高，储存时间长且不降解，干种子运输方便，是生产饲用疫苗的最佳选择。

　　3表达策略的优化

　　优化外源基因的表达策略，既能提高抗原蛋白的产量，又能避免植物口服疫苗引起的低剂量免疫耐受。要获得高产量的外源蛋白，植物表达载体的设计需考虑从转录到翻译后修饰等各个表达阶段。选用表达能力更强的启动子或在目的基因上游添加增强子都能有效地提高外源基因的表达量；选用组织特异性启动子有利于抗原蛋白在植物的特定组织中积累；在抗原基因前添加Kozak序列有利于多肽合成的开始；选用植物偏爱的密码子可提高外源基因的翻译效率；利用SEKDEL序列可将抗原蛋白定位到内质网上，基于内质网含有丰富的分子伴侣和低剂量的蛋白酶，抗原蛋白可大量地积累且不降解；其他编码序列如叶绿体转运肽、大麦d一淀粉酶信号肽等均能有效地提高抗原蛋白在植物组织中的含量。

　　4利用转基因植物表达猪疫苗的研究进展

　　4.1断奶仔猪腹泻疫苗

　　断奶仔猪腹泻是一种由肠毒性大肠杆菌(ETEC)引起断奶仔猪死亡的重要的全球性疾病。T4纤毛是ETEC与小肠上皮细胞受体结合的主要致病因子，由上百个蛋白亚基FaeG组成。纯化的T4纤毛和大肠杆菌表达的FaeG均能通过口服诱导黏膜产生特异性免疫应答。

　　Huang Y H等人将FaeG转化到烟草中，叶片表达的FaeG蛋白占可溶性蛋白总量(TSP)的0.15％。Joensuu J J等人在FaeG前添加了一段编码序列(叶绿体转运肽)，使基因在烟草中的表达量提高，占TSP的1％。结果发现：叶片提取液经模拟胃液或模拟肠液消化2 h后，FaeG仍能保持稳定；植物表达的FaeG能有效地竞争性抑制ETEC与上皮细胞受体结合，并且抑制作用存在明显的剂量依赖性。

　　4.2猪传染性胃肠炎疫苗

　　猪传染性胃肠炎是一种高度接触传染性肠道疾病。诱发该病的传染性胃肠炎病毒(TGEV)为冠状病毒科冠状病毒属成员，其S糖蛋白及与抗原决定簇相关的N末端结构域均能诱导体内中和抗体的产生。通过口服亚单位疫苗使猪胃肠黏膜产生免疫应答是对抗TGEV的有效途径。

　　G6mez N等人将TGEV的S糖蛋白编码基因(gS)及N末端结构域基因(N-gS)分别转化到拟南芥中，叶片表达的S糖蛋白占TSP的0.03％～0.06％。给小鼠注射叶片提取液后，ELISA检测发现血清中存在中和抗体；免疫共沉淀试验结果表踞，抗体在30d内已经出现。随后，G6mez N等人尝试用马铃薯表达N-gs，给小鼠注射块茎提取液或喂食块茎后均能在血清中检测到中和抗体。Barry J L等将gS按玉米偏爱的密码子进行优化，然后与大麦仅一淀粉酶信号肽编码序列融合并导入玉米染色体中表达，玉米粒中的gS蛋白含量占TSP的1.2％ 。给仔猪喂食玉米粒并与口服等剂量的商品化减活疫苗作比较，接种亚临床感染剂量的TGEV后，仔猪的发病率、患病持续时间及临床严重性指数显示，玉米表达疫苗的免疫效果与减活疫苗接近。

　　4.3猪流行性腹泻疫苗

　　猪流行性腹泻是另一种能引起仔猪病毒性腹泻的重要传染病。猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于冠状病毒科，但与TGEV并无血清学交叉反应，其基因组编码的刺突蛋白被认为是对抗PEDV的主要靶抗原，而其中的一个由140个氨基酸组成的蛋白区域COE包含了病毒的中和表位。

　　BaeJ L等将COE基因转化到烟草中，转化植株叶片中含抗原10μg／g(占湿重)，给小鼠注射50～100μg蛋白提取液后抽取血清进行蚀斑减数中和试验。结果显示：空斑数量只有阴性对照组的1／3，这表明烟草表达的疫苗具有免疫原性。为证明口服该疫苗可产生全身及黏膜免疫应答，给小鼠喂食蛋白提取液后又进行了ELISA检测，发现血清和粪便中有大量的抗原特异性IgG及IgA。值得一提的是，喂食剂量为5mg时所产生的免疫效果要比1mg好得多，这充分说明口服植物表达疫苗后所产生的免疫应答具有一定的剂量依赖性。

　　4.4其他猪病疫苗

　　猪瘟、猪细小病毒病、猪伪狂犬病等均为国内常见的疾病，每年给养猪业带来巨大的经济损失。国外有学者报道，将猪瘟病毒的E2糖蛋白基因分别转化到莴苣和苜蓿中，给小鼠喂食植株叶片，30d后血清和粪便中的特异性IgG和IgA开始明显增多；还有学者用烟草表达猪细小病毒的衣壳蛋白VP2基因，通过注射或口服均可使试验动物获得特异性抗体。在国内，肖少波等 用烟草表达猪伪狂犬病毒保护性抗原gD基因，并证实了其抗原性。