猪克隆技术大应用！但存在着这样的问题……

点击：
日期：2020-06-08 09:18
来源：《猪业》2020年第2期

猪克隆技术在养猪业及生物医药领域的应用

王雯竞，吴霄，蔡更元，吴珍芳，李紫聪

华南农业大学动物科学学院，国家生猪种业工程技术研究中心

克隆技术是指通过无性繁殖获得基因型相同个体的技术。在哺乳动物中，体细胞核移植技术是应用最广泛、最有效的克隆技术之一。通过先进的显微操作技术将体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，并激活重构的卵母细胞使之发育成为一个新的动物个体，称为体细胞核移植技术（Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT）。SCNT的主要程序包括核供体体细胞选择与处理、受体卵母细胞准备、重构胚胎构建（去核卵母细胞与供体核融合）、重构胚胎激活、重构胚胎体外培养、胚胎移植至同期发情处理的代孕母猪、饲养管理代孕母猪至克隆小猪出生（图1）。

图1 体细胞核移植技术路线图

自从首次成功克隆出哺乳动物绵羊“多莉（Dolly）”以来，已经陆续成功克隆了20多种哺乳动物，包括牛、小鼠、山羊、猪、兔、猫、马、大鼠、狗、食蟹猴等。而SCNT也已经在医药生产、物种保存、家畜繁殖和干细胞治疗等方面得到广泛应用。目前，世界上已有几个生物技术公司可提供商业化的动物克隆服务，例如美国的Trans Ova Genetics公司可提供猪、牛、山羊和绵羊的商业化克隆服务；美国的ViaGen Pets公司可提供宠物狗、猫和马的商业化克隆服务；还有近年在中国成立的北京希诺谷生物科技有限公司和博雅秀岩生物技术有限公司可提供宠物狗和猫的商业化克隆服务，以及河南创源生物技术有限公司可提供猪的商业化克隆服务。尽管已经成功克隆出了多种动物，但克隆胚胎的发育出生效率很低，且出生的克隆动物常存在生理缺陷、早衰等问题，所以克隆效率低是限制SCNT应用的关键问题之一。
本文通过简要介绍猪克隆技术在养猪业和生物医药领域的应用，并讨论了克隆技术应用存在的问题和提高克隆效率的方法，以期为猪克隆技术的发展与应用提供参考。

1 猪克隆技术在养猪业的应用

1.1 优秀种猪扩繁

优秀种猪具有良好的生产性能，因此，优秀种猪的扩繁可提高猪场的经济效益。若采用传统的有性繁殖技术（自然交配和人工授精）对优秀种猪进行扩繁，由于基因在生殖传递过程中存在分离和自由组合的遗传规律，使得优秀种猪通过有性繁殖产生的后代的基因型与亲代不同，所以不一定性能优秀。而利用克隆技术对优秀种猪进行无性复制扩繁，可产生大批量的基因型一致的优秀克隆个体，从而可延伸优秀种猪的利用时间和空间，缩短育种年限，加快遗传进展和提高养殖效益。薛振华等人通过选取优秀种公猪的耳组织成纤维细胞作为核供体与体外培养成熟的猪卵母细胞进行核移植制备克隆胚胎，后续进行胚胎移植，并比较了克隆猪与普通公猪体质量和体尺的差异，结果显示差异并不显著，证实了SCNT用于复制优秀种猪的可行性。

1.2 地方猪种保种

我国是一个猪种资源非常丰富的国家，在1984年已列入《中国猪品种志》的猪种就有66个品种。在猪种资源中，许多地方猪种都有其自身的优势，例如太湖流域的太湖猪有高繁殖力，东北地区的民猪具有强适应性，我国特有的香猪肉质好等。然而随着各地保种工作不当又盲目引进外来品种进行杂交，使原有品种数量减少、品质下降，甚至有的猪种濒临绝种。因此，地方猪种资源的保种工作至关重要，对我国猪种资源可持续性利用具有重大意义。活体保存是应用最普遍的方法，但它存在许多弊端，例如所需成本高、实际操作困难、易受环境影响等。随着克隆技术的发展，若将SCNT应用到保种工作中，可简化猪种资源的保种程序，减少人力物力资源投入。广东温氏食品集团股份有限公司在2013年运用手工克隆技术成功培育出25头克隆莱芜猪，证实了克隆技术在中国地方猪种保种工作中的可行性。

1.3 性状改良的基因编辑猪制备

受精卵原核注射技术一直以来是获得转基因动物最有效的方法，但因其基因的整合时间和位置是随机的，从而导致生产转基因动物效率低、成本高等。随着克隆技术的发展，SCNT与基因修饰技术相结合可以共同用于生产转基因猪。不仅可以提高转基因猪的生产效率，还可以对内源基因进行修饰获得一系列具有优良经济性状的基因修饰猪。例如猪CD163蛋白是蓝耳病病毒感染猪肺泡巨噬细胞的主要受体，王少华等人通过对CD163基因进行敲除，同时结合SCNT技术获得2头抗蓝耳病的克隆猪。而猪肌肉生长抑制素基因（MSTN）是肌肉生长的负调节因子，Wang等人利用CRISPR/Cas9系统将MSTN基因敲除，再经SCNT获得表现双肌的克隆猪。因此，通过利用SCNT和基因编辑技术可培育出具有优良经济性状的新品种猪。

2 猪克隆技术在生物医药领域的应用

2.1 人类异种器官移植供体猪制备

随着终末期器官衰竭等疾病日益增多，器官移植就成了治疗人类器质性疾病最理想的治疗方法。由于人源器官资源有限，异种器官移植就成了缓解供体短缺问题最有效的方法。因猪具有与人类相似的器官大小、功能以及解剖学特征等，又不存在灵长类动物方面的伦理问题，因此在人类异种器官移植方面具有巨大的应用前景。但作为异种移植供体仍面临着两大难题：免疫分子不相容性障碍和猪内源性逆转录病毒（Porcine Endogenous Retrovirus, PERVs）的传播风险。α-1,3-半乳糖基转移酶（α-1,3-galactosyltransferase, GGTA1）催化合成的α-1,3-半乳糖（Galactose-α-1,3-galactose, Gal）在异种器官移植中会引起超急性排斥反应，猪体内的补体系统激活也会引起排斥反应。而通过GGTA1基因敲除，并转入补体调节因子可以使异种移植的器官存活时间更长和功能效应得到显著提高，例如在2016年，Mohiuddin等人将GTKO/hCD46/hTBM基因编辑猪的心脏异种移植到狒狒体内，并结合免疫抑制剂维持治疗，使其存活时间最长达到945天。而PERVs作为整合到猪基因组中的病毒，可感染多种人源细胞。在2017年，Niu等人[21]通过利用CRISPR/Cas9灭活猪的原代细胞系中所有的PERVs，并通过SCNT产生PERVs灭活猪，而且在后期的生长发育过程中没有发现PERVs感染，因此可为异种器官移植提供安全有效的资源。

2.2 人类疾病动物模型制备

与其他动物相比，由于猪具有与人类相似的解剖结构、生理特性以及疾病发生机理等，因此，猪被认为是目前作为研究人类疾病最佳的动物模型。人类疾病模型可以通过基因修饰技术与克隆技术相结合来制备，例如Zhou等人利用CRISPR/Cas9分别对猪胎儿成纤维细胞的TYR基因以及PARK2和PINK1双基因进行敲除，再通过SCNT成功构建人类白化病和帕金森病模型猪，证实了猪克隆技术在人类疾病模型制备中的应用，可为医药临床应用前试验提供动物模型。

2.3 药用蛋白生物反应器制备

随着基因编辑技术与SCNT的发展，对猪的功能蛋白进行人源化修饰可用于生产药用蛋白。Yang等人利用CRISPR/Cas9系统对猪成纤维细胞中的INS基因进行编辑，结合SCNT技术成功获得了能在猪胰腺中表达人胰岛素的转基因猪，可用于治疗糖尿病患者，也为胰岛异种移植提供更加理想的供体。Peng等人运用CRISPR/Cas9将人白蛋白cDNA敲入猪Alb基因位点的起始密码子下游，首次获得制备人重组血清白蛋白的猪生物反应器。随着医疗技术的进步，人们对重组蛋白药物的需求逐渐增加。而猪具有资源丰富、生产力高、成本低等优势，因此，可作为生产重组蛋白药物的主要生物反应器。

3 猪克隆技术应用存在的问题及其解决方法

3.1 猪克隆技术应用存在的问题

自从2000年第一头克隆猪诞生以来，有关克隆猪的研究就迅速发展起来。然而，由于猪的克隆效率仍低，克隆胚胎在发育过程中也常常表现出流产、死亡等异常现象，这在很大程度上限制了克隆技术在猪中的发展和应用。而引起克隆胚胎异常发育的因素有很多，例如技术操作不当、培养环境不适等。经大量研究发现，表观遗传学重编程异常是导致克隆胚胎发育缺陷的主要原因。表观遗传修饰是促进基因正确表达的主要因素，而在克隆胚胎中常见异常的表观遗传修饰模式，从而导致与发育相关的重要基因不能正确表达，使克隆胚胎发育异常。表观遗传学重编程异常主要包括DNA甲基化异常、组蛋白修饰异常、Xist基因异常激活等。

3.2 提高克隆效率的方法

小鼠作为哺乳动物研究的模式生物，在研究表观遗传学重编程及改进克隆技术等方面具有显著的优势。目前，对克隆小鼠中的表观遗传学重编程已有了一定的研究进展，例如Rybouchkin等人运用组蛋白脱乙酰酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitor, HDACi）曲古他汀A（TSA）维持组蛋白的高乙酰化，形成开放的染色质结构，确保供体基因组可与重塑因子结合进行重编程。随后Matoba等人通过基因敲除或RNA干扰介导的基因敲除使位于X染色体上的非编码基因Xist正常表达，从而使小鼠克隆胚胎的存活率提高了10倍。随着对克隆小鼠表观遗传学重编程的研究逐渐成熟，研究者们开始探讨是否可以采用类似的方法来提高猪的克隆效率。在2010年，Zhao等人研究发现了一种新型的HDACi“Scriptaid”可使猪克隆胚胎的囊胚率提高2倍多，克隆效率提高4倍。2016年，Zeng等人借鉴在克隆小鼠中的研究，采用相同的方式抑制Xist基因表达，结果显示克隆胚胎发育成足月仔猪、活仔猪和健康仔猪的比率（0.53%、0.43%、0.17%）均高于未经处理的对照组（0.48%、0.32%、0.08%），证实了抑制Xist基因的表达可提高克隆猪的发育能力。因此，借鉴提高克隆小鼠发育能力的方法来提高猪克隆胚胎发育效率是一个行之有效的策略。

4 展望

随着克隆技术在养猪业中的发展，使得优秀种猪的扩繁和地方种猪的保种工作更加经济、便捷。而且克隆技术与基因编辑技术的结合，可扩大基因编辑克隆猪的应用范围。不仅为养猪业培育出新的优良品种，还可运用于生物医药领域构建人类疾病模型、生产医疗药物等。虽然对猪克隆技术的研究已取得了明显的进展，但仍存在克隆效率低等问题，因此，对技术的完善与改进至关重要。异常的表观遗传修饰是导致克隆效率低的主要原因，随着测序技术的发展，使得对异常的表观遗传学重编程机制的研究更加快速准确。通过对异常的表观遗传修饰进行修改，可提高克隆效率，从而极大的促进和推动克隆猪在养猪业和生物医药领域的应用。