吴珍芳教授团队在转基因猪生物反应器领域取得重要研究进展

 近日，我校动物科学学院、国家生猪种业工程技术研究中心吴珍芳教授团队在《cells》杂志（2022 IF：7.666）发表了题为“Genetically Engineered Pigs as Efficient Salivary Gland Bioreactors for Production of Therapeutically Valuable Human Nerve Growth Factor”的研究论文。论文链接为https://www.mdpi.com/2073-4409/11/15/2378。该论文在国际上首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器，高效合成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白—人神经生长因子。该论文为生产高活性的人类药用蛋白提供了一种高效的新技术，拓展了畜牧动物在人类医学中的应用，给人类健康带来了新的福音。该论文也是吴珍芳教授团队继2018年在《Elife》杂志 （2018 IF：7.616）发表了一篇关于“唾液腺特异表达外源消化酶的节粮环保转基因猪”的论文后，在转基因猪唾液腺生物反应器领域的又一重要研究进展。吴珍芳教授及其团队的李紫聪教授为上述论文的共同通讯作者，博士后曾芳（现为我校海洋学院教师），研究生廖莎和邝哲为该论文的共同第一作者。论文主要受国家转基因科技重大专项和国家自然科学基金项目资助。 

论文首页截图

神经生长因子（Nerve Growth Factor, NGF）对神经细胞的生长、分化和再生都有重要作用。它对一些神经性疾病，例如青光眼和阿尔茨海默病等，有良好的治疗效果。NGF由生物学家Rita Levi-Montalcini 和Stanley Cohen发现并鉴定其功能，两人因此获得了1986年的诺贝尔医学生理奖。

由于鼠源的NGF(mouse NGF, mNGF)与人源的NGF(human NGF, hNGF)蛋白的同源性很高，从小鼠唾液腺组织中分离纯化的mNGF蛋白在2002年已被中国政府批准作为药物用于治疗人的一些神经损伤疾病。但是mNGF蛋白的稳定性和生物活性是低于hNGF蛋白的。最近，美国和欧盟批准了大肠杆菌表达的hNGF蛋白可作为药物用于治疗人的神经源性角膜炎疾病。该药也已被中国政府批准可进口在国内销售和使用。然而，大肠杆菌表达的hNGF蛋白有可能由于缺乏某些重要的翻译后修饰而导致其生物活性降低。因此，通过哺乳动物细胞表达的hNGF蛋白应该活性更高，更具治疗价值。

动物的唾液腺天然表达高活性的NGF蛋白，这意味者唾液腺是表达NGF蛋白的一个理想组织。此外，家畜的唾液腺是潜在的高效生物反应器，它有以下优点：（1）家畜从出生至死亡，在整个生命周期都可以在唾液腺中表达具有潜在治疗作用的药物蛋白，并分泌至唾液中。而常用的家畜乳腺或家禽输卵管生物反应器只能在产奶期或产蛋期表达药用蛋白并分泌至乳汁或鸡蛋中；（2）雄性和雌性的转基因家畜都能用作唾液腺生物反应器来生产药用蛋白，但家畜乳腺或家禽输卵管生物反应器只能利用雌性的转基因动物；（3）家畜每天的唾液分泌量很大，有利于高效分泌表达的药用蛋白。例如猪、山羊、牛平均每天分别分泌唾液 15、6-16、60-190 升；（4）使用手术性或非手术性的方法可以从家畜收集大量的唾液用于目的蛋白纯化。 

利用转基因猪唾液腺生物反应器合成hNGF蛋白示意图

吴珍芳教授团队利用piggyBac转座系统结合体细胞克隆法制备了在唾液腺中特异高效表达hNGF蛋白的转基因猪，该转基因猪在其唾液中分泌高水平高活性的hNGF蛋白。吴珍芳教授团队利用他们所建立的手术性和非手术性唾液收集法从转基因猪的口腔高效收集到大量含hNGF蛋白的唾液，利用尺寸排除色谱法从收集的唾液中成功纯化获得hNGF蛋白，并证明该hNGF蛋白对神经细胞的增殖和分化具有良好的生物活性。为了防止从转基因猪的唾液中纯化hNGF蛋白时被内源表达的猪神经生长因子（pig NGF, pNGF）蛋白“污染”，该团队在转hNGF基因猪的基础上利用CRISPR/Cas9系统结合同源重组，把转基因猪内源的pNGF基因用另一个拷贝的hNGF基因替换，并通过体细胞克隆法生产出携带两个拷贝的hNGF基因，且不能表达内源pNGF蛋白的双转基因猪。该转基因猪生物反应器具有巨大的应用前景。