非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗构建和免疫保护特性研究，可作为疫苗候选株

摘要：本研究以我国首例非洲猪瘟疫情中分离的流行毒株(SY18)为亲本株构建了多基因家族(MGF)基因和CD2v基因缺失的非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗候选株，针对基因缺失株的安全性和免疫保护效果进行了特性研究。结果显示，MGF和CD2v双基因缺失株对猪安全，接种猪能够100%抵抗亲本毒株SY18株的攻击，对照猪全部死亡。

迄今，国际上采用基因工程手段获得了多个ASFV基因缺失疫苗候选株，以及通过细胞传代致弱和从自然界分离弱毒株的方法获得了弱毒疫苗候选株，其中一些疫苗候选株在研究报道中针对同源病毒株攻击有50%~100%保护率，但对异源病毒的攻击保护效果不甚理想。此外，无论是人工基因缺失弱毒株还是自然缺失弱毒株，猪免疫后出现剂量依赖性副反应，免疫猪出现精神沉郁，食欲降低，发热、病毒血症、高丙球蛋白血症、肺炎、关节肿胀、跛行、慢性病变和僵猪等，降低了疫苗的实际使用价值。人工基因缺失株尽管具有很好的免疫标记，但基因缺失疫苗的有关报道不多。目前人们普遍关心的是非洲猪瘟基因缺失株和自然弱毒株作为疫苗的安全性问题。我国现有国情决定了我国现阶段应走疫苗免疫防控路线。

ASFV拥有超大基因组，长160~ 190 kb，编码160多种蛋白，其中50多种为结构蛋白。病毒编码的蛋白成分中，很多具有免疫抑制特性，但目前通过与自然弱毒株基因组序列的比较和分析等方法确认的与免疫抑制有关的基因只有少数几种，包括CD2v、MGF、9GL等。在已经报道的自然弱毒株和构建的基因缺失株当中，研究较多的是MGF和CD2v基因缺失株。本研究利用国内报道的第1起疫情的病毒分离株SY18株首先构建了MGF、CD2v单基因缺失和二者的双基因缺失共3株重组病毒。动物安全性和免疫效果试验证明，MGF基因单缺失和MGF、CD2v双基因缺失毒株对免疫猪既具良好的安全性又呈现很好的攻毒保护效果，现将相关研究结果报告如下：

首先构建同源重组用质粒。从ASFV流行株SY18株基因组中扩增获得CD2v和MGF基因侧翼各1200bp序列作为同源重组质粒同源臂。CD2v两侧翼片段间克隆有绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)基因，MGF两侧翼片段中克隆红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)基因表达框。

之后进行重组病毒拯救和纯化。将二者的同源重组质粒(2μg)分别转染6孔细胞培养板中的猪的原代肺泡巨噬细胞培养物(细胞数约为106个)，4h后感染SY18株(1 MOI)，48h后挑取荧光细胞(含有重组病毒)，经3轮有限稀释法纯化筛选，分别获得了ASFV SY18△CD2v、ASFV SY18△MGF和ASFV SY18△MGF/△CD2v共3株基因缺失病毒。对拯救的重组病毒进行PCR鉴定和序列分析以及纯净性检验，证明我们成功获得了CD2v和MGF单基因缺失毒株(ASFV SY18△CD2v和ASFV SY18△MGF)及二者双基因缺失毒株(ASFV SY18△MGF/△CD2v)。病毒的总体构建策略如图1所示。

图1 ASFV 基因缺失病毒构建策略图

最后开展了重组病毒特性研究。共用35只健康猪，均分为7组，分别接种3株病毒的2种接毒剂量，具体接种方案如表1。

表1 生物安全评价接种方案

记录7组猪的体温和临床表现，并对免疫猪血液、粪、唾液进行ASFV核酸PCR检测。结果表明：

1.组1和组2中猪接种ASFV SY18△CD2v毒株后次日起体温出现升高，高达42°C以上，3~5 d内全部死亡。说明CD2v单基因缺失没有明显致弱病毒毒力。这和国外文献报道结果不一致。

2.组3中猪接种103 TCID50的ASFV SY18△MGF后，次日开始有的猪出现体温升高，持续1~3 d，但均未超过41.3C ，随后恢复正常，后期未见体温异常，观察期精神状态正常，采食量未见异常;组4中猪接种104 TCID50的ASFV SY18△MGF后次日有的猪出现体温升高，体温范围在40.2~41.3C之间，持续8~13日不等，随后恢复正常，未见精神沉郁或采食量减少等临床症表现。

3.组5、6中猪以103TCID50 和104TCID50剂量接种ASFV SY18△MGF/ △CD2v后，只出现1~2d内体温升高，体温均在40.5C以下，随后体温恢复正常，采食量和精神状态均未见异常。说明，MGF基因缺失可显著降低ASFV毒力，与国外有关研究结果一致;在MGF基因缺失基础上进一步缺失CD2v基因，可明显降低单纯缺失MGF基因的ASFV所引起的较长时间的发热反应，安全性进一步提高。对观察期内采集的血液、粪、唾液进行的ASFV核酸检测结果表明，在血液、唾液中可偶尔检测到病毒核酸，粪便中检测结果阴性。

对组3、5、6中的5头猪在免疫后28d，连同组7中5头攻毒对照猪，以ASFV SY18强毒株进行攻毒试验，攻毒方式为口服，攻毒剂量为103 TCID50，观察35日。结果，组3.5.6中免疫猪均获得完全保护，在观察期内检测体温均在正常范围内，未见任何异常临床表现。对照组5只猪全部发病，42℃以上高烧持续2~7 d后全部死亡。结果说明，ASFV SY18△MGF/△CD2v不仅具有很好的安全性，而且具有良好的攻毒保护效果，可作为良好的ASF预防疫苗候选株。

ASF属于OIE规定的必须通报的动物传染病，我国将其归类为一类传染病。在目前控制ASF传染源、切断传播途径、保护易感动物等生物安全措施均不能完全奏效情况下，研发安全有效的疫苗，保障生猪供应是我国生猪养殖刻不容缓亟需解决的问题。尽管疫苗的使用有可能纵容传染源的存在、放松传播途径的切断，甚至在很大程度上给ASF根除带来严重挑战，但从保障国内生猪供应和解决国计民生角度考虑，在可控范围内使用疫苗可能是目前在缺乏有效手段阻止ASF传播情况下无奈且唯一有效的选择。

本研究采用基因工程方法构建了缺失ASFV 毒力基因的缺失株，对其在动物体内的免疫效果和安全性进行了初步评价，显示免疫MGF单基因和MGF、CD2v双基因缺失的猪对ASFV强毒攻击具有完全的保护作用，说明其可作为我国非洲猪瘟疫苗候选株，值得进一步研究和探索。目前全球范围内，很多学者对非洲猪瘟疫苗的研发持怀疑甚至反对态度，这主要是因为ASFV不能诱导机体产生中和抗体，在猪体产生免疫保护的情况下，强毒依然可感染并产生病毒血症。研究证实，ASFV自然弱毒株在试验猪可造成严重的副作用，更有可能出现新的变异和新的流行。因此使用疫苗对于消除非洲猪瘟确实是不利的。进一步提高疫苗候选株的安全性和扩大疫苗效力的评价范围以及更为长期的生物安全评价对于非洲猪瘟疫苗而言是十分必要的。

已经报道的ASFV毒力相关基因有多种，本研究只选择了目前国际上报道较多的MGF和CD2v基因作为缺失对象。我们的结果显示，CD2v基因单独缺失对病毒毒力影响有限，而MGF基因(含3个MGF505基因和3个MGF360基因)缺失后，高剂量免疫后尽管会引起较长时间的体温升高，但是不影响机体的精神状态和采食量。在低剂量免疫时，导致机体长时间发热的现象消失。在MGF缺失基础上进一步缺失CD2v基因后，病毒接种引起的长时间发热现象基本消除，说明尽管CD2v单基因缺失株毒力很强，但CD2v基因缺失能够进一步降低MGF缺失株的毒力。

尽管我们构建的ASFV双基因缺失疫苗具有很好的安全性和免疫保护效果，但由于ASFV结构复杂，病毒感染和免疫机制尚未完全明确，且ASFV产生的抗体不具中和活性，因此ASFV SY18△MGF/△CD2v长期使用的安全性及免疫持续期有待进一步评价。从安全性的角度考虑，研究ASFV亚单位疫苗、病毒载体疫苗等也将是未来非洲猪瘟疫苗研究的重要方向。